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Lentiviral Packaging Kit

慢病毒包装试剂盒的产品说明:

慢病毒包装试剂盒的产品特性:

慢病毒包装试剂盒的产品应用:

慢病毒包装试剂盒的订购方式:

Lentiviral Packaging Kit

产品名称 货号 规格 价格 说明书下载

BioGeek™ 慢病毒包装试剂盒

(BioGeek™ Lentiviral Packaging Kit)

BG20401S

20 assays

¥3200

下载

BG20401L

40 assays

¥5000

【产品说明】

BioGeek™ 慢病毒包装试剂盒由优化的包装质粒混合物 (Package Plasmid Mix) 、表达 EGFP 的对照质粒(Control Plasmid) 、 EpFect™ Transfection Reagent 组成。它属于第二代慢病毒包装体系,同时可兼容第二代和第三代慢病毒包装质粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒,即产生的慢病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞,也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。 BioGeek™ 慢病毒系统具有感染效率高,感染谱广等特点,可实现外源基因在宿主细胞中的稳定持续表达。经该试剂盒包装获得的对照质粒病毒滴度可达 108 TU/ml。

【储存条件与有效期】

4℃ 保存 12个月(溶解后的质粒溶液需 -20℃ 保存)。


【操作步骤】

一、慢病毒载体准备

1. 获取含有目的基因的慢病毒载体:合生基因提供定制化慢病毒载体构建服务,多种启动子、多种抗性筛选标记、多种荧光标记可供选择,可实现基因的过表达、 shRNA/miRNA 介导的基因沉默、 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除等。

2. 根据不同规格中包装质粒混合物 (Package Plasmid Mix) 及 EGFP control 质粒的量,使用前 ddH2O 稀释成 1 μg/μL 的质粒溶液;

注:溶解后的质粒切忌反复冻融,需按照使用量进行分装并于 -20℃ 保存。

二、慢病毒包装

1. 细胞准备:转染前一天,将 3-5×106 的 293FT 或 293T 细胞接种到 10 cm 细胞培养皿中,放置于 37℃,5% CO2 培养箱培养 16 h~24 h。

注:细胞要充分消化,成团细胞影响转染效率。

2. 细胞转染:

(1) 取一支 1.5 mL EP 管(标记为 A 管),分别加入 300 µL Opti-MEM medium 及 40 µL EpFectTM Transfection Reagent 进行稀释,混匀,室温静止 5 min;

(2) 另取一支 1.5mL EP管(标记为 B 管),加入以下试剂并混匀;

试剂名称 试剂数量
慢病毒载体(或 EGFP 对照质粒) 2.5 µL (1.0 μg/ µL)
慢病毒包装质粒混合物 7.5 µL (1.0 μg/ µL)
Opti-MEM medium 300 µL

(3) 将 A 管液体转入到 B 管内,混匀,室温静止 15-30 min;

(4) 将混合物逐滴均匀加入到 10 cm 皿中的 293FT 或 293T 细胞,轻微混匀,置于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养;

(5) 转染 6 h 后,吸去含有转染复合物的培养基,更换为 37℃ 预热的新鲜培养基。

注:转染前细胞密度达 80% 左右,细胞状态对于慢病毒包装至关重要。

3. 转染 48 h 后,收集病毒上清液,再加入 10-15 mL 新鲜的完全培养基 (DMEM + 10% FBS) 至 10 cm 细胞培养皿中,置于 37℃, 5% CO2 培养箱继续培养。

4. 转染 72 h 后,可进行二次病毒上清液收集,与 48 h 收集的上清液混合后使用 0.45 μm 滤器过滤,可直接感染目的细胞,或使用 BioGeek™ 慢病毒浓缩试剂盒 (BG20101) 进行浓缩后 -80℃ 保存。

注: (1)切忌反复冻融病毒,冻融一次病毒滴度将降低 10-20%。

(2)-80℃ 保存的慢病毒最好在半年内使用。

三、病毒滴度测定

1. 测定前一天,将生长状态良好的 293 细胞消化计数后稀释至 5×104/mL,加入 96 孔板, 100 µL/孔,为每个病毒准备 8-10 个孔。放入 37℃, 5% CO2 培养箱中培养。

2. 取一定量的病毒液感染细胞:在 EP 管中做 10 倍梯度稀释,连续 10 个稀释度。稀释方法如下:每种病毒准备 10 个 1.5 mL EP 管,每管加入 90 µL 培养液,往第一个管中加入 10 µL 病毒原液,记作 100;混匀后,吸取 10 µL 加入第二个管混匀,记作 10-1;依此类推 (100~10-8),在对应细胞孔中加入 10 µL 稀释好的病毒液并做好标记,培养 48-72 h 后观察结果。

3. 滴度计算:对于带有荧光标记的慢病毒可使用荧光计数法测定滴度。

4. 在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。假设为 X 和 Y,则滴度 (TU/mL) = (X+Y×10) × 1000/2/X 孔的病毒液的含量 (µL)。

四、慢病毒感染目的细胞

VSVG 包膜蛋白对不同的细胞和组织的亲嗜性有很大差异,在使用慢病毒感染目的细胞之前,需要查阅相关文献或进行预实验确定目的细胞的复感染指数 (MOI, multiplicity of infection)。

预实验方案:

1. 按照上述步骤包装EGFP对照慢病毒及确定慢病毒滴度;

2. 实验前一天,将生长状态良好的目的细胞消化计数后稀释至 5×104/mL,加入 96 孔板, 100 µL/孔。放入 37℃,5% CO2 培养箱中培养。

注:悬浮细胞不需要提前一天接种,实验前将细胞计数接种后,直接加入病毒混合液即可。

3. 配制不同 MOI 梯度 (1、10、100) 的慢病毒 + polybrene + 培养基混合液;

注:polybrene (BG20301) 为常用的促感染试剂,能够显著提高病毒对细胞的接触及感染效率,一般使用浓度为 2-12 μg/mL,但对某些细胞(如末端分化的神经元,DC 细胞等)毒性较大,初次使用建议先做毒性测试。

4. 吸去 96 孔板中目的细胞的培养基,加入 3 中配制的慢病毒混合液,放入 37℃,5% CO2 培养箱中继续培养;

5. 24 h 后更换为新鲜培养基继续培养;

6. 感染 48-72 h 后,荧光显微镜下观察荧光表达情况,确认目的细胞的感染条件和感染参数,感染效率=荧光蛋白表达的细胞数/同一视野中明场总细胞数 × 100%;

7. 如预实验未能找到合适的感染条件,可调整 MOI 梯度再次检测。

正式实验方案:确定了目的细胞的最佳感染条件和 MOI,可正式开始实验。

1. 包装目的质粒慢病毒;

2. 对目的质粒慢病毒进行收集浓缩及滴度测定;

3. 根据预实验测定的感染条件进行感染(感染流程与预实验相同)。

【注意事项】

1. 所有慢病毒操作均应尽量在 BSL2 级生物安全柜中进行,并佩戴一次性口罩和手套;

2. 本品仅可用于科学研究,不可用于临床治疗。


【应用实例】

1. EGFP control 质粒包装后,使用荧光计数法测定病毒滴度,滴度可达 4X108 TU/ml

组别 明视野 荧光视野
Control 实验图片 实验图片
10-1 实验图片 实验图片
10-2 实验图片 实验图片
10-3 实验图片 实验图片
10-4 实验图片 实验图片
10-5 实验图片 实验图片

2. EGFP control 慢病毒感染不同细胞情况

(1)感染 SKOV3 乳腺癌细胞,MOI = 5

明视野 荧光视野
实验图片 实验图片

(2)感染 KS410 食管癌细胞,MOI = 10

明视野 荧光视野
实验图片 实验图片

(3)感染 HepG2 细胞,MOI = 3

明视野 荧光视野
实验图片 实验图片

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